想象一下，假如世界失去了色彩，只剩下黑白灰的组合，我们眼前的风景会变成什么样？在电子显微镜下，我们所能看到的就是这样一个世界。电子显微镜能帮助我们观察微小的病毒、细胞超微结构，但它只能得到黑白的灰度图片。
而在最近，加利福尼亚大学圣地亚哥分校的研究者们研发了一种新技术，使得“用电镜拍彩照”成为了可能。他们用特殊染料标记样品，得到了多色的电镜成像，这是怎么做到的呢？
图片来自：S. R. Adams et al
没有色彩的电镜世界
在过去，光学显微镜带领着人们第一次走进了肉眼不可辨别的微观世界，微生物和各种生命体内的微观结构开始为人所知。不过，当人们需要观察更加微小的结构时，光学显微镜的放大倍数就显得不够用了：受到衍射的影响，光学显微镜的分辨极限大约在200 nm，在此基础上即使再去放大，也无法看到清晰的成像了。为进一步提高分辨率，科学家们就用波长短得多的电子束替代了可见光，制造出了电子显微镜。电子显微镜使微观成像的分辨达到了 0.1 nm，这项重要的技术的研发者1986年获得了诺贝尔物理学奖。
然而，电子显微镜也有自己的缺点：这是一个没有色彩的黑白世界。可见光有不同色彩，我们也可以很方便地给生物组织的特定成分加上染色或是荧光标记。而电镜获得的图像是反映电子多少（即亮度）的“灰度图”，其中没有色彩信息。当然，人们可以给电镜图片进行后期上色，但这样的上色并不能选择性地突出所要观察的结构。如果原图中的灰度差别不大，后期上色也会很难将它们分开。
这张色彩梦幻的噬菌体图片来自透射电子显微镜，它的颜色就是“伪彩色”。图片来自：Sterling Publishing
为了让电镜图片更加“突出重点”，科学家们已经做出了很多努力，例如加入重金属来提高“对比度”。生物主要是由碳氢氧氮这样比较轻的元素构成，电子透过得到的图像对比度较低（就像是一幅淡淡的铅笔画）。而如果用重金属（如锇、铀或者铅）把背景染成深色，或是让它们与脂质或蛋白质进行结合，就可以得到更加黑白分明的图像。但是，这样做依然无法重点区分特定的生物分子。还有科学家尝试将这些重金属颗粒与抗体结合，让它们结合到特定的生物分子上去，但这种“标签”难以进入细胞，因此适用范围还是有限。
负染法示意图。图片来自：quazoo.com
为黑白图像染上“颜色”
而这一次，研究者们带来了一些为电镜图片“染色”的新思路。他们给染料分子连上了不同的镧系金属元素，并让这些染料沉淀到特异性标记的周围。虽然电子显微镜下依然没有真正意义上的色彩，但通过投射电子的能量损失不同，这些染料可以产生彼此区分的信号。这样一来，就相当于给样品加上了不同的色彩标签。
研究者们将显色剂二氨基联苯与镧系金属耦合在一起，作为电子显微镜的“特制染料”。想要标记生物分子时，就给对应的抗体连上荧光集团或是氧化酶分子，再通过光或者酶来诱发反应，让染料沉积到目标周围。在完成“染色”之后，再按照常规的氧化锇负染以增强对比度，进行电镜成像。
Ln-DAB2染料和染色方法：用带有氧化分子（红色为荧光分子，绿色为辣根过氧化酶）的抗体特异性标记目标分子（图中为红色标记线粒体和绿色标记核膜），分别让不同的Ln-DAB2染料在抗体附近原位氧化沉淀。再经过常规样品处理并分别成像，使用计算机处理得到彩色图像。
在成像时，研究者用一束动能一致的电子投射到样品上。当电子通过样品时，会与其中的原子发生碰撞，进而损失一部分能量，在用不同染料处理过的地方，电子的能量损失会产生明显的差异。通过检测这些差异，就可以让染色位置从背景中脱颖而出了。通过计算机处理，将不同染料对应的信号分别转换成不同的伪彩色，再与原始的黑白电镜图片叠加，这样就得到了我们在开头处看到的电镜彩照。
彩色电镜分别成像：A为传统电镜图；C和D分别为标记的线粒体和细胞膜；E是伪彩叠加图
闹了半天，颜色还是“假的”？的确，区分了能量差异，电子束依然没有真正的颜色。不过，与“纯靠想象”的后期上色相比，染料的标记还是起了很大作用。论文作者证明，这种方法可以分别用于细胞和组织的染色，并足以将不同的分子标记从传统的黑白电镜成像中分离出来。
彩色电镜的应用：星形胶质细胞分享突触结构图（F）；细胞透膜肽介导的内吞囊泡图（H）；新合成PKM 在神经元中的定位图（D）
目前，这种方法还只能在拍出三种“色彩”：它们分别被标记为红色、绿色和黄色。研究者希望，将来还能加入更多颜色种类，进一步提高图像的对比度。
在过去二十年中，超高分辨荧光显微成像技术正突破着光学显微镜的成像极限，而现在，电子显微镜的世界也变得多彩了起来。这些技术的进步都将带领科学家们更深入地了解细胞内部的精细构造，揭开更多微观世界的生命奥秘。
（编辑：窗敲雨；排版：Sol_阳阳）
参考资料：
1.http://www.cell.com/cell-chemical-biology/fulltext/S2451-9456(16)30357-9
2.https://www.jic.ac.uk/microscopy/intro_EM.html
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